上皮細胞體外培養(yǎng)的特殊條件

(1)防范微生物污染：

根據(jù)上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機會較多。

要求在組織取材時就嚴(yán)格滅菌；

分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設(shè)法消除可能會出現(xiàn)的微生物污染。

培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括細胞保存液、分離液以及培養(yǎng)基等需添加抗生素，抗生素濃度比其它組織培養(yǎng)高。

(2)生長基質(zhì)的支持：

上皮細胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細胞。

在培養(yǎng)器皿表面包被生長基質(zhì)，如膠原或其它細胞外基質(zhì)成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，不僅特別有利于上皮細胞的貼附和生長，也有利于培養(yǎng)細胞的分化．使細胞極性表現(xiàn)更為明顯。

(3)特殊的培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基有M199、RPMl 1640、DMEM和HamFl2。

其中以M199和RPMl 1640較為常用。

M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存，對上皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。

DMEM和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時有其特殊作用。

可促進上皮細胞的貼附；

維持上皮細胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。

HamFl2培養(yǎng)基的特殊性

特別適用原代上皮細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機離子，更加利于細胞的生長和代謝。

在實際培養(yǎng)時，將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。

加入血清，但出廠血清成分復(fù)雜，含有一定量的有毒物和抑制物。

(4)去除成纖維細胞：

上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。

取材分離細胞時會帶入少量結(jié)締組織成分，常常造成成纖維細胞與上皮細胞混和生長。由于成纖維細胞具有增殖能力和粘附能力強的特點，很容易“瘋長"為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢細胞群，從而干擾或抑制上皮細胞的生長，成為上皮細胞的“細胞污染源"。

因在上皮細胞的取材、分離、種植和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意上皮細胞的純化，去除和抑制成纖維細胞的生長。

內(nèi)皮細胞：

來源：人臍帶臍靜脈，動物動脈

消化：用膠原酶比胰蛋白酶消化好。

但要注意掌握消化時間和雜細胞（成纖維細胞和平滑肌細胞）。

內(nèi)皮細胞的鑒定

用免疫組化染色檢測VIII因子相關(guān)抗原和CD34抗原, 鑒定內(nèi)皮細胞。

觀察細胞是否呈單層貼壁生長, 細胞形態(tài)，如長梭形、多角形三角形、四邊形為主, 呈典型的“鋪路石"樣征象 ；

觀察第三代細胞純度是否達95%以上。

如消化時間過長或操作不慎、刮取過重時，會造成血管內(nèi)皮下層與外膜成纖維細胞以及中膜平滑肌細胞污染。由于這些雜細胞生長較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。

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